Лженаука – генетика. Чума ХХ века.

II.23. Нокауты генов

 

 

 

Вторым способом использования способности нуклеиновых кислот интерферировать в местах, где цепи нуклеотидов комплементарны друг другу, стал метод удаления генов или их мРНК. Используется два подхода: нокаут гена и нокдаун гена. Нокаут гена (англ. gene knockout) — это метод при котором из организма удаляют или делают неработоспособными определенные гены. Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, изменённый так, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию или химерный ген вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцист (ранняя стадия эмбриона) суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.

 

Чтобы встроить ген в кольцевую ДНК, которая чаще всего используется для внедрения гена в клетку, применяют ферменты — рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и кольцевую ДНК можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген, а затем заключая его в ту самую кольцевую ДНК. Кольцевые ДНК, используемые для введения инородного гена в геном, часто называют векторами.

 

Ученые научились внедрять в клетки гены, которых у них ранее не было. Делается это обычно путем продырявливания плазматических мембран. Через дырки в цитоплазмы поступают гены в составе кольцевой ДНК. В сущности, процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.

 

У эукариот (клеток с ядрами) нокаут гена (разрушение здорового гена) производят путём использования феномена гомологичной рекомбинации (обмена нуклеотидными последовательностями) между сравнительно небольшим участком инородной (экзогенной) и клеточной ДНК.

 

Трансформированные эмбриональные стволовые клетки вносят в зародыш, и полученных химерных животных скрещивают для получения линии мышей, гомозиготных по полученной мутации.

 

Вектор, используемый для нокаута, несет клонированную последовательность изучаемого гена, с внесенными в нее необходимыми изменениями. Это может быть: внесение стоп-кодона, приводящее к синтезу короткого неактивного пептида; удаление одного или нескольких экзонов; делеция (удаление) промоторной (стимулирующей) области, расположенной перед самим геном; вставка, приводящая к нарушению нормального функционирования гена и любые другие изменения, приводящие к отсутствию функционального продукта изучаемого гена или значительно снижающие его активность. Также в эту последовательность вносится положительный селективный маркер, на основе которого синтезируется белок, делающий несущие его клетки устойчивыми к антибиотикам неомицину и канамицину. Модифицированная последовательность нуклеотидов должна быть окружена с обеих сторон неизмененными участками, по которым будет проходить рекомбинация (взаимообмен) с ДНК в хромосоме.

 

При этом существует вероятность, что рекомбинация пройдет не по исследуемым нами участкам генома, а в любой другой сходной области. Эта проблема решается внесением в векторную конструкцию маркера отрицательной селекции. Им может служить ген дифтерийного токсина А (DT-A), продукты которого убивают эукариотические клетки. Клетки, в которых взаимообмен (рекомбинация) прошел неправильно, синтезируют данный токсический ген и погибают. Остаются лишь небольшое количество клеток, где рекомбинация прошла там, где надо. Как все это делается, подробно описано в методических книжках. Я не буду загружать вашу память. Кто хочет, может найти эти сведения в Интернете.

 

Эмбриональные стволовые клетки мыши впервые получены в 1981 году, что дало возможность для развития работ по инактивации генов. Внесение нашего вектора в эмбриональные стволовые клетки возможно с помощью микроинъекции, химического (помощью липидов или других веществ) или физического (электропорация) кратковременного перфорирования плазматической мембраны, или с помощью заражения клеток вирусом, в геном которого встроен наш вектор. Наиболее экономичными и достаточно эффективными методами внесения экзогенной ДНК в клетку являются электропорация и ретровирусная инфекция. К их достоинствам, в первую очередь, следует отнести возможность одноразово обработать сотни тысяч клеток, которые благодаря системе позитивной-негативной селекции достаточно быстро проходят отбор.

 

После того, как линия трансформированных клеток получена и поддерживается, их вносят в эмбрион мыши (как правило, на стадии бластулы). Затем содержащий наши клетки химерный зародыш подсаживают в матку ложно беременной самки. Полученную таким образом химеру скрещивают с нормальным, но имеющим отличия (например, цвет) животным, пока не будет получена гомозиготная линия. Результатом будет получение линии животных, гомозиготных по созданной мутации. Не все гены можно инактивировать на стадии зародыша – для них существуют боле сложные генно–инженерные методы.